Depois do segundo piloto de Roddenberry, "Where No Man Has Gone Before", ter recebido uma resposta mais favorável da NBC, Star Trek finalmente foi ao ar com seu primeiro episódio – "The Man Trap" – às 20h30 do dia 8 de setembro de 1966. "Where No Man...", que eventualmente foi ao ar como o terceiro episódio da série, retinha apenas o personagem Spock de "The Cage", porém introduziu William Shatner como Capitão Kirk, James Doohan como o Engenheiro Chefe Scotty e George Takei como o físico (mais tarde piloto) Sulu. DeForest Kelley e Nichelle Nichols se juntaram ao elenco como o Oficial Médico Chefe Dr. McCoy e a Oficial de Comunicações Uhura em "The Man Trap". Apesar de sua personagem Número Um não ter sido mantida depois de "The Cage", Majel Barrett retornou para o programa como uma nova personagem, enfermeira Christine Chapel, e fez sua primeira de muitas aparições recorrentes em "The Naked Time". Grace Lee Whitney apareceu em oito episódios como ordenança Janice Rand, começando com "The Man Trap". Whitney deixou a série após "The Conscience of the King", porém faria aparições rápidas no primeiro, terceiro, quarto e sexto filmes da franquia, como também no episódio "Flashback" de Star Trek: Voyager. A primeira temporada de Star Trek compreende 29 episódios, incluindo o episódio em duas partes "The Menagerie", que inclui muito das imagens do piloto original, "The Cage". Outros episódios notáveis incluem "Balance of Terror", que introduz os romulanos; "Space Seed", que introduz Khan Noonien Singh e serve como base para Star Trek II: The Wrath of Khan; "Errand of Mercy", onde os klingons fazem sua primeira aparição; e o aclamado pela crítica, episódio vencedor do Hugo Award, "The City on the Edge of Forever", que mostra Kirk, Spock e McCoy viajando para o passado através do Guardião da Eternidade.
